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荧光PCR检测进入“分钟”级时代:百泰克23分钟RNA检测技术

浏览数量: 0     作者: 本站编辑     发布时间: 2022-07-05      来源: 本站

荧光PCR检测进入“分钟”级时代:百泰克23分钟RNA检测技术

新冠疫情的爆发,使得全球卷入了这场没有硝烟的战斗中,相较2021年,疫情虽正在往好的方向发展,但全球确诊人数依然超过5.4亿1,2。


等温扩增


核酸检测是确诊 SARS-CoV-2 感染的最主要依据。目前可用于 RNA 病毒的核酸检测技术主要有基因测序、聚合酶链式反应(PCR)、等温核酸扩增等。其中荧光定量PCR检测方法是首选方案3

然而反转录实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)的检测方法需要依赖温控精度良好的热循环仪,并且PCR反应中必须的变性、退火和延伸步骤,使整个扩增检测时间较长,难以实现对SARS-CoV-2的现场快速检测4

核酸等温扩增技术无需热循环仪,扩增反应效率高、速度快,非常适合于病原体核酸的现场快速检测。因此不少相关从业人员,都曾把核酸快速检测的希望,寄托于等温扩增技术上面。


不同等温扩增技术优劣

不少核酸等温扩增方法已相继被用于SARS-CoV-2的检测。包括依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、交叉引发扩增技术(CPA)、切刻内切酶核酸扩增反应(NEAR)等。

这些技术原理各异,产物检测方法各不相同,造成它们在检测SARS-CoV-2时的灵敏度、特异性、靶标基因、所需仪器、检测时间等方面存在差异。



市面上这几种等温扩增的方法各有优缺点,以下来分析:

SAT是在 NASBA 技术的基础上,进一步提高了检测的灵敏度和特异性,但是并未能从根本上克服NASBA 技术反应时间长的问题。

荧光RT-RAA法:荧光RAA方法灵敏度较高。但是对样品核酸品质要求较高,需要搭配传统的提取方法。并且样品同一时间只能检测单一靶标基因。

CPA实时荧光法:CPA扩增产物采用分子信标进行检测,然而这个方法的通量太小。此外交叉引物的设计要求较高,在研发过程中,引物的筛选和测试,十分繁琐。这可能会造成基于该技术的检测试剂平台开发周期较长4

LAMP芯片法:可利用肉眼观察颜色变化,或灰度检测来判读检测结果,虽然降低了对仪器设备的要求,适合在资源有限和经济不发达地区开展核酸检测,然而主观判断颜色变化存在较大个体差异5,有可能影响结果判读。


除了上述提到的情况外,等温扩增还有以下一些问题

1、样品前处理(核酸提取)是等温扩增一个主要制约因素。

2、如何实现单管闭管条件下的多重或多靶标等温扩增检测,并同时具有高灵敏度和特异性,也是亟待解决的技术难题。

3、在理论上等温扩增技术不能够通过反应时间来指示核酸扩增量,这难以实现精准的定量检测,更加适合于半定量或定性检测。

4、某些等温扩增方法,如 LAMP 等温扩增涉及多个引物,往往需要通过优化引物设计来确保核酸检测的特异性与灵敏度,这提高了其技术实现难度8


现阶段而言,某些等温扩增技术具有一定现场应用的前景,然而目前的产品通量偏低,时间偏长和灵敏度偏低,还是限制了这项技术的应用场景7。这些缺点限制了等温扩增的发展,也造成了等温扩增技术空有好的设想却迟迟无法落地的困境。

那有没有既兼具了等温扩增快速、仪器简单的特点,而又有传统荧光定量PCR特异性好、准确度高的检测方法?答案是有的。快速荧光定量PCR就是这个问题的终极解决方法。它既有传统荧光定量PCR准确度高,灵敏度好的特点,而又通过技术革新,具备比等温扩增更快速完成实验的能力。



革新

传统的荧光定量PCR实验时间长,是由于受到仪器升降温速度,以及传热的效率所限,整个实验时间时长一般为70-120分钟。


一般来说,荧光定量PCR反应的温度条件是较为固定的,既然无法改变温度条件,若想提高整个实验的速度,那么只能从两方面着手进行优化:一是提升温控性能,二是提高热传递效率。百泰克公司历时三年研发的PCR仪,就是从这两方面入手,打破传统荧光PCR反应时间的枷锁,为整个荧光定量PCR技术带来革新。



百泰克快速荧光定量PCR仪BTK-8,采用先进的升降温模块,升降温可达12℃/s,平均升降温速度为10℃/s,为传统荧光PCR仪的3-5倍。由于变温PCR反应时,温度需要从58℃提升至95℃,再降至58℃,如此循环40~45次,因此升降温速率的提升可将原本70-120min的检测提速至20~30min完成。

耗材方面,BTK-8摒弃了传统的0.1ml、0.2ml PCR反应管,采用新型的注塑工艺与柔性膜结合技术,研发芯片式反应耗材,适合大规模机械化生产,成本进一步降低。


单个芯片包含有10个独立的样品孔,芯片加样孔较小,不容易与空气进行交换,从而大大降低了孔洞间的气溶胶交叉污染的可能性,检测体系具有超高的检测准确性,可达到ABI Q6同等灵敏度,且芯片加样无需离心去掉气泡,操作起来更加便捷。



从下表可以看出,现在BTK-8这款快速定量PCR仪,已经能把实验时间压缩至30分钟以下,而且检测下限能够达到200 copies/ml,能满足现在的检测需求。相比于等温扩增技术,快速荧光PCR的时间更短、准确性更高。



结语


在过去的时间内,等温扩增技术凭借其简单快速、便于在基层单位推广的特点,在部分人畜共患病、妇科恶性肿瘤、以及多种呼吸道疾病的检测中发挥着一定的作用。然而伴随着BTK-8快速荧光PCR仪的横空出世,使得相关的检测有了一个更好的选择。能提供更快捷、准确实验结果的快速荧光定量PCR仪,将会完美替代等温扩增的检测手段,在多个领域中发挥巨大作用。


特别是在新型冠状病毒疫情仍然全球流行的时期,由于各国防控情况不平衡,新型冠状病毒或将在相当长的一段时间内与人类共存,甚至有可能会成为一种长期存在的一种呼吸道传播病原体。而在口岸快速排查,基层发热门诊快速分流的实际需求,均要求能够提供快速、准确、有效的实验检测结果。相比于等温扩增技术、BTK-8快速荧光PCR仪则更能满足这些场景的需求。


参考文献

1. Steven Sanche, Yen Ting Lin, Chonggang Xu, et al. High Contagiousness and Rapid Spread of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 [J]. Emerging Infectious Diseases, 2020, 26(7):1470-1477.
2. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard [DB/OL].[2020-07-07]. https//covid19.who.int/.
3. Wang Y, Kang H, Liu X, et al. Combination of RT-qPCR testing and clinical features for diagnosis of COVID-19 facilitates management of SARS-CoV-2 Outbreak [J]. JMed Virol, 2020, 92(6):538-539.
4. 李博,邹秉杰,马雪萍,武海萍,张晏洁,周国华. 用于新型冠状病毒检测的核酸等温扩增技术研究进展[J].病毒学报,2021,37(1):191-200.
5. 李欢,徐秋月,王云娟,利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法[J]. 昆明医科大学学报,2021, 42(9):25-31.
6. Jürgen Rodel, Renate Egerer, Aynur Suleyman, et al. Use of the variplexTM SARS-CoV-2 RT-LAMP as a rapid molecular assay to complement RT-PCR for COVID-19 diagnosis [J]. Journal of Clinical Virology, 2020.
7. 马学军. 核酸等温扩增技术的应用现状与思考[M]临床实验室. 2022.
8. 涂芸萍,杨殿龙,张中平等. 基于微流控芯片的等温扩增技术[J]. 生物工程学报, 2022, 38(3): 943-960.
9. Song J, Liu C, Mauk MG, et al. Two-stage isothermal enzymatic amplification for concurrent multiplex molecular detection [J]. Clin Chem, 2017, 63(3): 714-722.

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